HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG BỘ TRANG THIẾT BỊ Y TẾ CHẨN ĐOÁN IN VITRO PHÁT HIỆN VI RÚT CORONA (SARS-COV-2)

Trần Hoàng Huy    19/12/2020 11:52:58

Bộ trang thiết bị y tế chẩn đoán in vitro phát hiện vi rút Corona (SARS-CoV-2) do Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á kết hợp cùng Học viện Quân y nghiên cứu và sản xuất. Bộ trang thiết bị y tế này phát hiện đặc hiệu vùng gene N của vi rút SARS-CoV-2. Xét nghiệm này được thực hiện bằng phương pháp Real-time RT-PCR trên các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp (dịch mũi họng, dịch súc họng, đờm, dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi….). Đây là bộ sản phẩm “ready to use” (sẵn sàng sử dụng), các thành phần đóng gói trong 01 hộp, tube chứa hóa chất tương thích với các dòng máy PCR, có hướng dẫn chi tiết.

 Với hình thức sử dụng đơn giản, đi từ quy trình tách chiết thu RNA của vi rút corona (SARS-CoV-2) đến đặt phản ứng real-time RT-PCR.

QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT

Bước 1:
- Lấy 200µl dung dịch mẫu cho vào tube 900µl dung dịch pER1.
- Vortex 30 giây, để yên 10 phút.

Bước 2:
- Thêm 200µl pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube chuyển sang màu trắng đục.
- Ly tâm 13,000 vòng/ 5 phút.

Bước 3:
- Lấy 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 tube biopure có sẵn 600μl dung dịch pEX3. Lắc đều, sau đó để yên 10 phút
- Ly tâm 13,000 vòng/ 5 phút.  Loại bỏ lớp dịch nổi, thu phần kết tủa màu hồng.

Bước 4:
- Thêm từ từ 900µl dung dịch EX4
- Ly tâm 13,000 vòng/ 3 phút.  Loại bỏ lớp dịch nổi, thu phần kết tủa màu hồng.

Bước 5:
- Ủ 65oC trong khoảng 10 phút.
- Cho vào 50μl dung dịch ER5. Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phần kết tủa tan hoàn toàn.

QUY TRÌNH ĐẶT PHẢN ỨNG REAL-TIME RT-PCR

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.

Nếu máy real-time PCR đọc từ đáy của tube: Viết kí hiệu mẫu trên nắp hoặc trên thân phần gần sát nắp. Nếu máy real-time PCR đọc từ nắp của tube: Viết kí hiệu mẫu trên thân phần thân sát nắp.

Cho 5μl dịch RNA từ tách chiết hoặc 5μl chứng dương hoặc 5μl chứng âm vào từng iVASARS-CoV-2 1stRT-rPCR Mix. Phải kiểm tra chắc chắn phần dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng.

Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm.

Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR (nhớ ly tâm).

Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc real-time ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy tính đã kết nối với nhau (xem HDSD máy real-time PCR). Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 105oC thì chương trình luân nhiệt mới bắt đầu.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup  trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Với mẫu: Chọn loại mẫu là “Unknown”. Đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu của mẫu.

Màu “FAM”, “TEXAS RED” “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.

Màu “FAM”: Phát hiện trình tự mục tiêu SARS-CoV-2. Màu “TEXAS RED”:

Phát hiện trình tự mục tiêu SARS-like coronaviruses. Màu “HEX”: Phát hiện trình tự chứng nội.

Bước 3: Cài đặt chương trình “Protocol”:

- 1 chu kỳ: 50oC-10 phút,
- 1 chu kỳ: 95oC – 5 phút;
- 45 chu kỳ: 95oC – 15 giây, 55oC – 45 giây

Cho máy real-time PCR chạy chương trình. Trên đây là cách cài đặt chung nhất, tùy thuộc vào loại máy mà có thể có cách cài đặt khác nhau, phải tham khảo HDSD của máy để cài đặt đúng nhất.

ĐỌC KẾT QUẢ

Trừ thời gian một giờ để tách mẫu bệnh phẩm khoảng 40 - 60 phút (xử lý vô trùng, bất hoạt virus, tách RNA), Kit thử cần khoảng một giờ sẽ cho kết quả.